Estudio del papel de la proteína PII en el control por carbono mediado por el sistema regulador CbrAB

Resumen

Motivación: Pseudomonas es un género de bacilos Gram negativos quimiorganótrofos aerobios pertenecientes al grupo de las gamma-proteobacterias que engloba un gran número de especies, algunas de gran interés biotecnológico, medioambiental o biosanitario como  P. putida o P. aeruginosa, consideradas excelentes sistemas modelo por gran versatilidad y su fácil manipulación. La caracterización del metabolismo de Pseudomonas es de gran utilidad para muchas aplicaciones biotecnológicas, por lo que se profundizará en la regulación del metabolismo del carbono mediado por el sistema regulador CbrAB, y su posible interacción el metabolismo del nitrógeno. Estudios del metaboloma de P. putida realizados en el grupo indican que, ante de limitación de carbono, existen niveles elevados de α-cetoglutarato, molécula inductora del sistema de control por nitrógeno NtrBC, mediado por la proteína PII (M. García- Mauriño, 2013). Se pretende determinar si la proteína PII del sistema Ntr, está implicada en la activación del sistema Cbr. Para ello se estudiará si la activación de las dianas crcZ y PP2810, controladas por CbrB, está también bajo el control de la proteína PII.

Método: Estudio de la expresión génica mediante ensayo de la actividad β-galactosidasa (Miller, 1992) de una fusión transcripcional al promotor de crcZ  y del gen PP2810 en un fondo silvestre y un fondo mutante PII (ΔglnK), en distintas condiciones de disponibilidad de carbono/Nitrógeno. Como control llevaremos una fusión nifL::lacZ, controlada por PII. Los ensayos se realizarán a partir de pre-inóculos en medio mínimo con succinato para el fondo silvestre y en LB para el fondo mutante PII como fuente de carbono y amonio como fuente de nitrógeno, y se realizarán inducciones en  medio rico LB y otros medios con distinta disponibilidad de carbono, como son Succ/NH4, Succ /Ser, Succ/Gln, OAA/ NH4, Pir/ NH4 y Arg/ NH4, todos ellos con antibiótico, y se incubarán hasta una fase exponencial media (A600= 0,3-0,5),tras las cuales se realizará el ensayo.

Resultados: Los valores de actividad observados en succinato no difieren significativamente de los valores en oxalacetato, estas diferencias si son significativas para PP2810, para el cual obtenemos  diferencias de inducción en los medios LB, succinato y oxalacetato, piruvato y arginina, aunque la inducción es mucho menor que la observada para CrcZ.

Conclusión: En base a los datos preliminares obtenidos CrcZ no parece estar regulado por pII en las condiciones ensayadas.